引言

在當今醫(yī)學研究領域，基因沉默技術的發(fā)展為治療各種遺傳性和獲得性疾病提供了新的可能性。尤其是，永久性表觀遺傳沉默的概念，即通過修改DNA周圍的化學結(jié)構而非改變DNA序列本身來抑制特定基因的表達，為我們提供了一種潛在的治療手段。這種技術不僅能夠靶向并沉默疾病相關基因，還能保留基因組的完整性，減少潛在的遺傳風險。

表觀遺傳編輯技術，尤其是CRISPR技術的最新進展，已經(jīng)顯示出在細胞和動物模型中靶向特定基因并實現(xiàn)其沉默的巨大潛力。這一技術的成功應用預示著我們距離實現(xiàn)精準醫(yī)療又近了一步，尤其是在遺傳性疾病和某些類型的癌癥治療領域。

2月28日Nature的報道的研究“Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing”，圍繞一種新型的表觀遺傳編輯工具——進化工程轉(zhuǎn)錄抑制因子（EvoETR，evolved engineered transcriptional repressor），通過對Pcsk9基因的靶向沉默，不僅驗證了這種工具在體內(nèi)實現(xiàn)基因沉默的能力，而且還證實了其沉默效應的持久性和特異性。Pcsk9基因作為調(diào)節(jié)膽固醇代謝的關鍵因子，其沉默對于治療高膽固醇血癥及其相關心血管疾病具有重要意義。

研究表明，通過一次性的表觀遺傳編輯，可以實現(xiàn)對Pcsk9基因的長期沉默，而且該技術具有較高的安全性和特異性。這些發(fā)現(xiàn)不僅為表觀遺傳編輯技術的臨床應用奠定了基礎，也為使用該技術治療其他遺傳性和獲得性疾病提供了重要的實驗數(shù)據(jù)支持。

表觀遺傳編輯技術

表觀遺傳編輯技術是近年來生物醫(yī)學領域的一大突破，它允許研究人員在不改變DNA序列的前提下，調(diào)控基因的表達。這項技術的核心在于對基因組周圍的化學標記進行精確的修改，從而影響特定基因的活性。其中，CRISPR技術的發(fā)展為表觀遺傳編輯提供了強有力的工具，使得目標基因的精確編輯成為可能。

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技術，最初被發(fā)現(xiàn)為細菌的一種免疫機制，用以抵御外來病毒。研究人員隨后開發(fā)出基于CRISPR的Cas9蛋白質(zhì)，能夠在DNA上尋找并切割特定序列，實現(xiàn)基因編輯。表觀遺傳編輯則進一步擴展了CRISPR技術的應用范圍，通過將Cas9蛋白質(zhì)與不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合，不切割DNA鏈的情況下調(diào)控基因的活性。

通過表觀遺傳編輯實現(xiàn)基因沉默

基因沉默是表觀遺傳編輯中的一項關鍵應用，它通過修改DNA周圍的表觀遺傳標記來抑制特定基因的表達。這些表觀遺傳標記包括DNA甲基化和組蛋白修飾等，它們影響基因轉(zhuǎn)錄的啟動和進行。例如，DNA甲基化通常發(fā)生在基因啟動子區(qū)域，導致轉(zhuǎn)錄機制無法識別和結(jié)合，從而實現(xiàn)基因的沉默。

表觀遺傳編輯技術通過精確地定位到目標基因的啟動子區(qū)域，使用特定的編輯復合物（如融合了轉(zhuǎn)錄抑制因子的dCas9蛋白）介導甲基化或其他表觀遺傳修改，從而實現(xiàn)對基因表達的靜默。這種技術的優(yōu)勢在于其可逆性和高度的特異性，相比傳統(tǒng)的基因敲除技術，表觀遺傳編輯能夠在不改變基因組本身的情況下，實現(xiàn)對疾病相關基因的有效調(diào)控。

表觀遺傳編輯技術的發(fā)展為基因治療領域帶來了新的希望，它不僅為研究基因表達調(diào)控機制提供了強大的工具，也為治療遺傳性疾病和癌癥等疾病開辟了新的途徑。隨著該技術的不斷完善和應用，未來有望實現(xiàn)更加精準和安全的基因治療策略。

主要的表觀遺傳編輯工具

表觀遺傳編輯作為一種前沿科技，其核心在于利用特定的DNA結(jié)合平臺精確調(diào)控基因表達，而不改變DNA序列本身。

不同的DNA結(jié)合平臺比較

Zinc-finger：作為一種早期的基因編輯工具，zinc-finger蛋白可以被設計來識別特定的DNA序列。盡管其設計靈活，但在實際應用中，zinc-finger的特異性和穩(wěn)定性仍存在局限。

TALEs（Transcription Activator-Like Effectors）：與zinc-finger相比，TALEs提供了更高的定制性和更強的DNA結(jié)合能力。TALEs通過其獨特的重復序列識別DNA，使得在基因編輯中具有更高的精確性。

dCas9（deactivated Cas9）：基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的dCas9技術，通過去活化Cas9蛋白的切割功能，保留其DNA結(jié)合能力，成為了一種高度靈活和特異性強的基因調(diào)控工具。dCas9可與不同的效應器結(jié)合，實現(xiàn)基因的激活或沉默。

EvoETR的設計及其優(yōu)勢

進化工程轉(zhuǎn)錄抑制因子（EvoETR，evolved engineered transcriptional repressor）代表了表觀遺傳編輯工具的新一代。EvoETR的原理是結(jié)合DNA結(jié)合域（DBD）和效應域（ED）于一個單一分子中，以便靶向和調(diào)控特定基因的表達。

DBD是專門設計的，可以精確結(jié)合到基因組中特定的DNA序列，確保EvoETR能夠精準地定位到目標基因。常見的DBD包括鋅指蛋白（ZFPs）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應子（TALEs）和CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的dCas9（催化失活的Cas9），它們都可以被用來引導EvoETR到指定的基因位點。

ED是負責執(zhí)行基因沉默功能的部分，通常來自于自然存在的轉(zhuǎn)錄抑制因子。在EvoETR中，ED可以通過招募組蛋白修飾酶等機制，在目標基因的啟動子區(qū)域引入抑制性的表觀遺傳標記，如組蛋白甲基化，從而抑制基因的表達。

通過將DBD和ED組合在一個分子中，EvoETR能夠靶向并持久地沉默特定基因的表達，而不需要持續(xù)的外源因子介入，這為治療人類疾病提供了一種新的策略。EvoETR的設計旨在提高靶向性和減少脫靶效應，使其成為一種安全且有效的基因調(diào)控工具。

該研究中的EvoETR結(jié)合了dCas9的高特異性DNA結(jié)合能力和先進的轉(zhuǎn)錄抑制因子，使其在基因沉默方面展現(xiàn)出卓越的性能，具體表現(xiàn)為：

高度特異性：EvoETR通過精確設計的dCas9與特定基因啟動子結(jié)合，確保了目標基因沉默的高度特異性，減少了非目標效應的風險。

持久效果：通過引入先進的轉(zhuǎn)錄抑制因子，EvoETR能在表觀遺傳層面實現(xiàn)基因的持久沉默，即使在細胞分裂過程中也能保持沉默狀態(tài)。

廣泛適用性：EvoETR的設計不僅適用于人類細胞，也能在多種模型生物中有效應用，為基因療法的研究與開發(fā)提供了廣闊的平臺。

安全性：與傳統(tǒng)的基因剪切技術相比，EvoETR通過表觀遺傳層面調(diào)控基因表達，避免了對DNA序列的直接修改，從而提高了治療的安全性。

Pcsk9基因沉默的研究

研究選擇Pcsk9基因作為目標基因進行研究，原因在于其在調(diào)節(jié)血漿膽固醇水平、尤其是低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）中的重要作用。Pcsk9基因編碼的蛋白能夠促進LDL受體的降解，減少肝細胞表面的LDL受體數(shù)量，從而影響血漿中LDL-C的清除。因此，Pcsk9的功能失調(diào)與多種心血管疾病的風險增加密切相關。

編輯工具的選擇與優(yōu)化

研究團隊首先評估了多種表觀遺傳編輯工具，包括zinc-finger、TALEs以及dCas9系統(tǒng)，最終選擇了具有高特異性和高編輯效率的進化工程轉(zhuǎn)錄抑制因子（EvoETR）進行進一步研究。EvoETR的設計旨在通過特定的表觀遺傳標記，如DNA甲基化，實現(xiàn)對Pcsk9基因的靶向沉默。

編輯效率的評估：通過定量PCR技術，測量每種編輯工具對Pcsk9基因表達水平的影響，從而評估其沉默效率。

特異性分析：通過全基因組測序技術，分析每種編輯工具可能引起的非目標效應，以確保編輯的特異性。

載體選擇與優(yōu)化：考慮到遞送效率和細胞毒性，對攜帶編輯工具的載體系統(tǒng)進行了篩選和優(yōu)化。

在Hepa 1-6 Pcsk9?細胞中進行的篩選（Credit:?Nature）

體外篩選

在進行體內(nèi)實驗之前，研究團隊在體外細胞模型中對EvoETR的效率和特異性進行了篩選和驗證。通過對不同設計的EvoETR進行比較，確定了最優(yōu)化的編輯器配置。

通過基于ZFP的ETRs對Pcsk9進行表觀沉默后，實現(xiàn)針對性轉(zhuǎn)錄的下調(diào)，同時最小化脫靶效應（Credit:?Nature）

體內(nèi)實驗設計

確定最佳編輯器后，研究團隊在小鼠模型中進行了體內(nèi)實驗，旨在評估EvoETR對Pcsk9基因沉默的效率及其對血漿LDL-C水平的影響。實驗設計包括對照組和實驗組，其中實驗組小鼠通過尾靜脈注射接收含有EvoETR的脂質(zhì)納米粒子（LNP）。在注射后的不同時間點，收集小鼠的血液樣本，通過ELISA技術測定血漿中PCSK9蛋白的水平，以評估基因沉默的效率。同時，通過PCR技術監(jiān)測Pcsk9基因的表達水平，以評估基因沉默的持續(xù)性。

安全性與特異性分析

在進行表觀遺傳編輯的實驗過程中，確保編輯操作的安全性與特異性是至關重要的。

編輯特異性和潛在的脫靶效應

特異性分析方法：研究人員采用了高通量測序技術，對編輯操作后的基因組進行了全面掃描，以識別可能的非目標編輯事件。此外，通過比對處理組與對照組的基因表達譜，進一步驗證編輯的特異性。

非目標效應評估：盡管EvoETR顯示出高度的特異性，但在極少數(shù)情況下，研究人員仍觀察到了微弱的非目標編輯活動。這些非目標效應主要集中在基因組的非編碼區(qū)域，且對細胞功能和生理狀態(tài)的影響極小。

風險管理措施：針對檢測到的非目標效應，研究人員采取了一系列風險管理措施，包括優(yōu)化編輯器設計、提高遞送系統(tǒng)的精準度，以及開發(fā)更為嚴格的篩選標準，確保治療的安全性。

治療后肝臟再生能力的保持

再生能力評估方法：通過對小鼠模型進行長期跟蹤觀察，評估了EvoETR編輯操作后肝臟的再生能力。特別是，研究人員監(jiān)測了肝臟損傷后的自然恢復過程，以及肝功能指標的變化情況。

實驗結(jié)果：EvoETR處理后的小鼠，其肝臟的再生能力未受明顯影響。肝功能指標（如ALT、AST水平）與對照組相比，沒有顯著差異，表明編輯操作不會損害肝臟的自我修復能力。

這一發(fā)現(xiàn)對于表觀遺傳編輯技術的臨床應用具有重要意義，說明了其在保持器官功能方面的安全性。

經(jīng)過脂質(zhì)體介導的ZFP-ETRs輸送后，在小鼠肝臟中對Pcsk9進行持久的表觀遺傳沉默（Credit:?Nature）

EvoETRs的體外功效和特異性分析（Credit:?Nature）

在通過LNP介導的EvoETR-8傳遞后，Pcsk9在體內(nèi)的表達被顯著抑制（Credit:?Nature）

研究的意義與應用潛力

表觀遺傳編輯技術，尤其是通過進化工程轉(zhuǎn)錄抑制因子（EvoETR）實現(xiàn)的基因沉默，已經(jīng)展示出其在醫(yī)學研究和疾病治療中的巨大潛力。這項技術不僅為我們提供了一種精準調(diào)控基因表達的方法，而且還開辟了一條通往一次性治療多種遺傳性和后天性疾病的新途徑。

疾病治療中的應用前景

遺傳性疾病的治療：對于那些由特定基因突變引起的遺傳性疾病，表觀遺傳編輯技術能夠直接靶向并沉默這些致病基因，從而根除疾病的根本原因。

癌癥治療：通過精準地調(diào)控癌細胞中的關鍵基因，例如促癌基因或腫瘤抑制基因，表觀遺傳編輯有望成為一種有效的癌癥治療手段，尤其是在傳統(tǒng)治療（如化療和放療）效果不佳的情況下。

感染性疾病的治療：針對某些病毒性疾病，例如HIV/AIDS，表觀遺傳編輯技術可以通過靶向并沉默病毒DNA來阻斷病毒復制，為治療提供新的策略。

一次性治療的可能性和優(yōu)勢

持久效果：與傳統(tǒng)的基因編輯技術相比，表觀遺傳編輯通過修改染色質(zhì)結(jié)構而非DNA序列本身，可以實現(xiàn)長期甚至永久性的基因沉默，從而為患者提供一次性治療的可能。

安全性：由于不直接改變DNA序列，表觀遺傳編輯減少了潛在的基因組不穩(wěn)定性和非目標效應，提高了治療的安全性。

可逆性：相較于永久改變DNA序列的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，表觀遺傳編輯的效果理論上是可逆的，這為控制和調(diào)節(jié)治療提供了更大的靈活性。

當前技術的局限性

編輯效率和特異性：雖然現(xiàn)有技術已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)相對高效和特異性的基因沉默，但在不同細胞類型和生物體中的效率及特異性仍有待提高。

長期安全性：關于長期對宿主基因組可能產(chǎn)生的影響，特別是潛在的非目標效應和基因組穩(wěn)定性問題，尚需進一步研究和監(jiān)測。

臨床應用的復雜性：從體外實驗到臨床應用存在許多挑戰(zhàn)，包括但不限于遞送系統(tǒng)的選擇、免疫原性問題以及個體差異的考量。

需要進一步研究的問題

遞送系統(tǒng)的優(yōu)化：開發(fā)更為高效、安全的遞送系統(tǒng)，以確保編輯工具能夠精確地到達目標細胞，是實現(xiàn)表觀遺傳編輯臨床應用的關鍵。

脫靶效應的最小化：通過改進編輯工具的設計和優(yōu)化編輯條件，進一步降低非目標效應，提高治療的安全性。

多基因疾病的治療策略：對于涉及多個基因的復雜疾病，如何有效整合表觀遺傳編輯技術，實現(xiàn)對多個目標基因的精準調(diào)控。

未來表觀遺傳編輯技術可能的發(fā)展方向

個體化醫(yī)療：結(jié)合個體的遺傳背景和疾病特性，定制化設計編輯策略，實現(xiàn)更為精準的治療。

組合治療：與傳統(tǒng)治療方法（如化療、放療）或其他新興治療技術（如免疫療法）結(jié)合，以提高治療效果和患者的生存率。

智能生物材料的開發(fā)：開發(fā)新型生物材料作為遞送載體，提高編輯工具在體內(nèi)的穩(wěn)定性和遞送效率。

倫理和法律框架的完善：隨著技術的發(fā)展和應用，建立相應的倫理和法律框架以指導研究和臨床應用，保護患者權益，是不可或缺的。

Q&A

表觀遺傳編輯與傳統(tǒng)基因編輯有何不同？

表觀遺傳編輯技術和傳統(tǒng)基因編輯技術在目標和機制上存在本質(zhì)的區(qū)別。傳統(tǒng)基因編輯，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，直接在DNA序列層面進行切割或替換，從而改變基因的表達或功能。相比之下，表觀遺傳編輯不直接改變DNA序列，而是通過修改DNA周圍的化學標記（如甲基化或乙?；?，影響基因的活性而不改變其編碼信息。這種方法允許更為精細的基因表達調(diào)控，減少了永久性基因改變帶來的風險。

EvoETR是如何設計的，其優(yōu)勢在哪里？

進化工程轉(zhuǎn)錄抑制因子（EvoETR）是一種創(chuàng)新的表觀遺傳編輯工具，通過篩選和優(yōu)化特定的轉(zhuǎn)錄抑制因子，實現(xiàn)對目標基因表達的高效沉默。EvoETR的設計過程包括使用高通量篩選技術從廣泛的候選因子中選擇具有最佳編輯活性和特異性的因子，然后通過進化工程進一步增強其性能。

EvoETR的主要優(yōu)勢在于其高度的特異性和調(diào)控的可逆性。與傳統(tǒng)基因編輯工具相比，EvoETR能夠精確地靶向特定基因，減少非目標效應的風險，同時其對基因表達的調(diào)控是可逆的，為未來的治療提供了更多的靈活性和安全保障。此外，EvoETR在沒有外部切割酶介入的情況下實現(xiàn)基因沉默，避免了DNA損傷和潛在的基因組不穩(wěn)定性，從而為患者提供了一種更為安全的治療選項。

在體內(nèi)實驗中如何確保編輯的特異性和安全性？

在體內(nèi)實驗中確保編輯特異性和安全性是表觀遺傳編輯技術研發(fā)的重中之重。為此，研究人員采用了多項策略來最小化潛在的風險。首先，通過精確設計編輯工具的靶向序列，確保其能夠特異性地識別并作用于目標基因，避免對非目標基因產(chǎn)生影響。其次，利用高通量測序技術對編輯后的細胞進行全面分析，評估非目標效應的發(fā)生情況。此外，通過在動物模型中進行長期的安全性跟蹤，評估編輯操作對生物體健康的長期影響。

表觀遺傳編輯在臨床應用中面臨的主要挑戰(zhàn)是什么？

表觀遺傳編輯技術雖然展現(xiàn)出巨大的潛力，但在臨床應用中仍面臨多重挑戰(zhàn)。首先，編輯效率和特異性的進一步提升仍是研究的重點，需要開發(fā)出更為精確和高效的編輯系統(tǒng)。其次，編輯工具的遞送方式也是一個重大挑戰(zhàn)，如何確保編輯工具能夠安全、有效地到達目標細胞并執(zhí)行其功能，需要進一步的技術創(chuàng)新。此外，長期安全性和潛在的免疫反應問題也需要在臨床前和臨床試驗中得到充分考慮和評估。最后，倫理和法律問題也是表觀遺傳編輯技術面臨的重要挑戰(zhàn)，需要在技術發(fā)展的同時，建立相應的倫理指南和法律框架，以確保技術的安全和負責任的應用。

原文鏈接

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07087-8

Cappelluti MA, Mollica Poeta V, Valsoni S, et al. Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. Published online February 28, 2024. doi:10.1038/s41586-024-07087-8